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    1. MICRORNA 靶基因驗證實驗

      服務價格及周期:

      服務編號 服務內容 價格 服務周期
      MRNA-1 靶基因3′-UTR雙熒光素酶野生型載體(?1.5kb) 1500元 1-2周
      MRNA-2 靶基因3′-UTR雙熒光素酶突變型載體(一個位點) 900元 1-2周
      MRNA-3 質粒提?。▋蓚€靶基因加一個對照質粒) 900元 1-2周
      MRNA-4 miRNA表達載體或mimic與雙熒光素酶載體共轉染(96孔板),雙熒光素酶檢測 5000元 1-2周

      microRNA靶基因驗證實驗概述

      當前,microRNA對靶基因的功能研究十分熱門。利用熒光素酶報告基因檢測實驗尋找或驗證microRNA對靶點作用性是不可或缺的實驗技術。本公司可為您提供microRNA報告基因載體構建服務,并可進一步為您提供熒光素酶報告基因檢測實驗服務。您只需要提供目的microRNA靶位點序列,我們專業的技術服務人員就可替您完成載體構建,為您節省大量的時間和精力。

      下圖為microRNA-reporter載體表達框架示意圖,具有多克隆位點,方便插入目的靶點序列。psiCHECK-2載體用于終點法的細胞裂解物檢測,包含螢火蟲熒光素酶基因,使海腎熒光素酶的表達水平歸一化,令該系統更可靠、重現性更好。使用psiCHECK-2載體時,由于是一個載體,無須通過共轉染進行歸一化。

      microRNA報告基因實驗流程:

      構建miR-reporter載體(含突變靶位點的熒光素酶報告基因載體)與內參質粒、microRNA mimics或 microRNA negativecontrol共轉染293T或Hela細胞。共轉染細胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,進一步驗確定目的 microRNA的靶基因。

      1.microRNA靶點的預測
      利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預測靶點序列。
      2.獲得microRNA靶點序列
      根據提供的靶序列,合成兩條互補的單鏈DNA模板?;蛘?,設計引物PCR擴增目的microRNA靶基因3’UTR序列,或直接合成。
      3.microRNA靶序列克隆
      將合成的兩條單鏈退火成雙鏈(具有粘性末端),或將PCR產物雙酶切,后連入經過同樣雙酶切的miR-reporter載體中,連接產物轉化大腸桿菌DH5α。
      4.陽性克隆鑒定
      挑選轉化的菌落,PCR篩選含有插入片段的陽性克隆,測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
      5.細胞轉染準備
      將含目的microRNA靶基因的報告基因載體、內參質粒和microRNA mimics或microRNA negative control共轉染293T或Hela細胞。
      6.熒光素酶檢測
      共轉染細胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,確定目的microRNA的靶基因。

      整理分析數據,得出結論:
      提供有microRNA靶序列的報告質粒,以及內參和對照質粒各一份。
      甘油保存菌株各一支。
      附mir-reporter載體的說明書
      以及實驗報告:
      包括載體構建過程,鑒定記錄,測序報告,細胞轉染,熒光檢測。

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